【摘要】介紹了流體動(dòng)力色譜(HDC)和障礙色譜(SC)及其在生物、化工分離中的研究進(jìn)展，著重于它們的分離原理、理論發(fā)展及二者之間的聯(lián)系與轉(zhuǎn)化，引用52篇文獻(xiàn)。
　　
　　【關(guān)鍵詞】動(dòng)力學(xué)液相色譜,流體動(dòng)力色譜,障礙色譜，DNA分離，評(píng)述
　　
　　AbstractHydrodynamicchromatography(HDC)andslalomchromatography(SC)calledasdynamicliquidchromatography(DLC)wereintroducedandreviewed,mainlyfortherecentdevelopmentofseparationprinciple,theoreticalmodel,andapplications.Fiftytworeferenceswerecited.
　　
　　KeywordsDynamicliquidchromatography,hydrodynamicchromatography,slalomchromatography,deoxyribonucleicacidseparation,review
　　
　　1引言
　　
　　隨著生命科學(xué)研究的不斷深入，液相色譜法(LC)在分離純化多肽及蛋白質(zhì)方面的應(yīng)用也得到了迅速地發(fā)展，盡可能提高其分離度已成為LC研究中*重要的課題之一[1,2]。多年來，研究溶質(zhì)組分的色譜保留行為基本上依據(jù)熱力學(xué)因素，即根據(jù)各組分在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)的差異實(shí)現(xiàn)對(duì)組分的分離，并且假定組分在該二相間的分配或吸附平衡是瞬時(shí)完成的。然而，早在1956年，荷蘭學(xué)者VanDeemter便提出了色譜過程的動(dòng)力學(xué)理論——速率理論[3]。他將色譜過程視為一個(gè)動(dòng)態(tài)的非平衡過程，研究分離過程中的動(dòng)力學(xué)因素對(duì)峰展寬的影響。此后，Giddings等[4]在VanDeemter方程的基礎(chǔ)上，提出了LC的速率方程，即Giddings方程，他們認(rèn)為溶質(zhì)在流動(dòng)相和固定相轉(zhuǎn)移的過程并不是瞬間達(dá)到平衡，實(shí)際上組分傳質(zhì)速度是有限的，說明分離中總是存在著動(dòng)力學(xué)的非平衡過程。液相色譜的分類是依據(jù)溶質(zhì)與固定相之間的作用特征，如電荷作用的離子交換色譜，疏水相互作用的疏水相互作用色譜和反相色譜，親合作用的親合色譜及分子大小的尺寸排阻色譜等。本文介紹的流體動(dòng)力色譜(hydrodynamicchromatography,HDC)和障礙色譜(slalomchromatography,SC)，其溶質(zhì)均與固定相之間的作用特征無關(guān)，或關(guān)系甚小，而主要與流動(dòng)相的流動(dòng)特征有關(guān)，或是基于動(dòng)力學(xué)因素發(fā)展起來的兩種新的色譜方法，二者通稱為動(dòng)力學(xué)液相色譜法。目前,它們已經(jīng)在測(cè)定和分離聚合物、多肽、DNA和生物大分子方面廣泛應(yīng)用。文獻(xiàn)[5]從與SEC比較的角度簡要地介紹了HDC和SC的分離原理及二者之間的不同點(diǎn)。本文詳細(xì)并系統(tǒng)地說明了HDC和SC的分離原理、模型、理論發(fā)展、儀器設(shè)備和*新應(yīng)用，并探討了HDC與SC之間的聯(lián)系及相互轉(zhuǎn)化。
　　
　　2流體動(dòng)力色譜(HDC)
　　
　　HDC是Small等20世紀(jì)70年代初就已開發(fā)出的一種可同時(shí)測(cè)定聚合物或膠體乳膠粒的直徑及其分布的方法[6~8]。他們采用了無孔剛性固體顆粒填充色譜柱，待分離乳液在高壓下通過色譜柱時(shí)，由于不同大小的溶質(zhì)所受到的水動(dòng)力效應(yīng)的不同，其乳液在流動(dòng)相中的移動(dòng)速度也不同，從而實(shí)現(xiàn)了聚合物或膠體懸浮液的分離。Mori等[9]進(jìn)一步發(fā)展和完善了HDC,并將其應(yīng)用到某些天然高分子的分離。后來人們發(fā)現(xiàn)在一根直徑為幾百微米的毛細(xì)管中同樣也可實(shí)現(xiàn)不同粒徑混合物的分離[10]。這種采用毛細(xì)管，而不是填充柱作為分離柱的分離方法拓寬了HDC的應(yīng)用范圍，這在理論研究和實(shí)際應(yīng)用上都有著非常重要的意義。用內(nèi)徑小于10μm的毛細(xì)管(稱其為微毛細(xì)管),其分離機(jī)理與內(nèi)徑大于10μm的毛細(xì)管略有不同，文獻(xiàn)[11~14]對(duì)微毛細(xì)管HDC進(jìn)行了詳細(xì)的理論探討和應(yīng)用研究。
　　
　　2.1HDC的原理
　　
　　2.1.1HDC柱
　　
　　毛細(xì)管HDC和填充柱HDC所需色譜裝置大體相同。二者的區(qū)別在于毛細(xì)管HDC采用管徑不同的毛細(xì)管作為分離色譜柱，而填充柱HDC則使用無孔剛性固體顆粒填充的色譜柱。相對(duì)于毛細(xì)管HDC,填充柱HDC的設(shè)備簡單，操作簡便，尤其是檢測(cè)手段的簡化，通常使用紫外檢測(cè)器便能滿足要求。而毛細(xì)管HDC受到進(jìn)樣量和檢測(cè)濃度的限制，要求檢測(cè)器較為靈敏，通常使用高靈敏度紫外檢測(cè)器或其它手段，如電位分析、激光激發(fā)熒光法及激光光散射法等[15]。
　　
　　2.1.2HDC分離模型
　　
　　盡管HDC包括了前述的兩種主要模式，毛細(xì)管HDC和填充柱HDC，而大部分有關(guān)HDC的理論都以前者為主[16,17]，由于可將填充HDC顆粒間的間隙視為毛細(xì)管體系，故填充HDC與毛細(xì)管HDC具有相同的分離模型。HDC的分離機(jī)理為：當(dāng)流動(dòng)相從填料顆粒間經(jīng)過時(shí)，由于水動(dòng)力效應(yīng)的存在使其流型為層流拋物面型，溶質(zhì)在這種情況下的分離主要是借助于靠近填料顆粒表面的低流速區(qū)域所產(chǎn)生的排斥效應(yīng)，大的溶質(zhì)分子由于受到的排斥效應(yīng)大于小溶質(zhì)分子，更容易遠(yuǎn)離填料顆粒表面而進(jìn)入高流速區(qū)域，這樣大分子溶質(zhì)的移動(dòng)速度大于小分子溶質(zhì)，從而先于小分子被洗脫出來。有多種模型描述了溶質(zhì)在HDC中的保留行為，*簡單的僅考慮了幾何學(xué)效應(yīng)，而常用的模型是DiMarzio和Guttman[16,18]及Brenner和Gaydos[17]依據(jù)幾何學(xué)原理而提出的保留時(shí)間和溶質(zhì)大小的關(guān)系。如圖1所示，溶質(zhì)分子在毛細(xì)管內(nèi)的遷移可用式(1)來表示：
　　
　　R=(1 Bλ－Cλ)－1(1)式中，R=tm/t0為溶質(zhì)的保留值與無限小的標(biāo)記物的保留值之比，也稱之為相對(duì)保留值；λ=de/dpor,de為溶質(zhì)的有效直徑，dpor是毛細(xì)管的直徑。B和C均為與幾何學(xué)有關(guān)的常數(shù)；C值介于0.5~5之間[１９]，在填充柱里C值介于2.7至2.8之間。
　　
　　從式(1)看出，粒徑不同的顆粒的相對(duì)停留時(shí)間是不同的，這樣具有不同大小顆粒的溶質(zhì)便可用HDC法進(jìn)行分離。由于大分子先于小分子被洗脫出來，因此，雖然它所用分離原理與尺寸排阻色譜(SEC)不同，但其洗脫順序卻與SEC相同。
　　
　　需要指出的是，在式(1)的推導(dǎo)過程中將被測(cè)粒子假定為剛性的不旋轉(zhuǎn)微球，而實(shí)際上對(duì)于流動(dòng)體系中的粒子來說，其上下所受的力是不平衡的，在力矩的作用下將發(fā)生旋轉(zhuǎn),這種轉(zhuǎn)動(dòng)又會(huì)影響其流動(dòng)速度。這個(gè)現(xiàn)象*早由DiMarzio[１６]和Brenner[１７]等論及。
　　
　　2.2HDC的發(fā)展和應(yīng)用
　　
　　HDC要求溶質(zhì)分子的大小與流經(jīng)管道直徑的比值不應(yīng)小于0.01，一般介于0.01~0.35之間[2０]。在HDC提出的初期，使用小孔徑的毛細(xì)管(50~500μmi.d.)，或者使用填充10~20μm填料的填充柱，其內(nèi)部管道相對(duì)較大，因此它們僅局限于分析一些較大的溶質(zhì)，如纖維和固體顆粒[2１，２２]。一般來說,采用小內(nèi)徑的毛細(xì)管，或非常小的粒徑均勻的微球作為填料時(shí)可顯著提**DC柱的柱效，可使用內(nèi)徑更小的(1~5μm)的毛細(xì)管和更小顆粒的填料(1~1.5μm)[１９，23]來提**DC的分離度。如Stegeman等[２４,２５]利用粒徑范圍在1.4~2.7μm單分散SiO2微球?yàn)樘盍希^好地分離了聚苯乙烯顆粒、膠體SiO2顆粒和蛋白質(zhì)等?？紤]到HDC的分離機(jī)理在SEC中同樣存在，故可將HDC與SEC結(jié)合,從而拓寬所分離溶質(zhì)分子量的范圍。Cheng等[2６]利用粒徑不同的玻璃微球?yàn)樘盍显谔畛渲蟹蛛x聚苯乙烯顆粒,以此討論了SEC和填充柱HDC之間的異同。Stegeman等[２７]利用填充有多孔的SiO2顆粒和苯乙烯與二乙烯基苯交聯(lián)共聚物顆粒的填充柱分離了聚苯乙烯顆粒，認(rèn)為小分子量聚苯乙烯顆粒主要按SEC機(jī)理分離，而高分子量聚苯乙烯顆粒則按HDC機(jī)理分離，分子量范圍可擴(kuò)充至102~107之間。這樣HDC的應(yīng)用范圍覆蓋了SEC的范圍[1３,２８]。
　　
　　分析分離儀器的微型化是當(dāng)今科學(xué)儀器發(fā)展的趨勢(shì)，可以減小試劑消耗、提高分離分析效率和縮短分析時(shí)間。但是，使用小內(nèi)徑的毛細(xì)管會(huì)增加檢測(cè)的難度[1３,1４]。為解決這個(gè)問題，Chmela等[２９,3０]設(shè)計(jì)了芯片HDC裝置，采用熒光檢測(cè)，在3min內(nèi)完成了熒光納米級(jí)微球的分離與檢測(cè)。由于硅微技術(shù)可以提供準(zhǔn)確的幾何形狀，硬度高，且耐有機(jī)溶劑和高溫腐蝕，所以該體系使用1μm×1000μm(深和寬)的硅刻槽作為分離管路，連接體積為300pL的進(jìn)樣器，并采用壓力驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相。該體系可提供十萬個(gè)理論塔板數(shù)，已用來分離聚合物和生物大分子顆粒，真正達(dá)到了芯片實(shí)驗(yàn)室的程度，并定性地驗(yàn)證了HDC理論。然而他們認(rèn)為這種保留和擴(kuò)散的模型需要從定量的角度上加以描述和改進(jìn)。Blom等[3１]也設(shè)計(jì)了熔融硅膠板狀的紫外檢測(cè)芯片HDC裝置，使用69mm×0.5mm×1μm的分離管道連接150pL進(jìn)樣器，其檢測(cè)池的深和寬皆為30μm，用此裝置分離了粒徑為26~155nm的熒光分子和聚苯乙烯混合物，并描述了平面HDC保留與擴(kuò)散行為以及壁效應(yīng)對(duì)擴(kuò)散的影響。上述兩種芯片裝置中的檢測(cè)器與分離管路結(jié)合在一起，因此兩者之間無死體積，這樣大大減小了溶質(zhì)峰的柱外擴(kuò)散，有效地提高了分離效率。
　　
　　3障礙色譜(SC)
　　
　　3.1SC柱及分理原理
　　
　　3.1.1SC柱
　　
　　SC所用儀器設(shè)備與常規(guī)HPLC所用設(shè)備基本相同。由于溶質(zhì)在SC中的分離與填料的孔徑和化學(xué)性質(zhì)無關(guān)，所以SC對(duì)色譜柱的要求相對(duì)簡單。已報(bào)道有使用C1反相柱[３２]，凝膠滲透色譜柱和[3３,3４]和離子交換色譜柱[３5]，流動(dòng)相與SEC所用流動(dòng)相相同，有時(shí)為了消除色譜柱的微弱的疏水作用，加入了5%~20%的有機(jī)溶劑，如乙睛。
　　
　　3.1.2SC分離模型
　　
　　SC是在1988年依據(jù)動(dòng)力學(xué)原理提出的一種新穎的方法，用于分離分子量相對(duì)較大(>5kbp)的DNA分子[３６,37]。一般認(rèn)為，SC的分理機(jī)理是：DNA分子的分離主要依靠流速和填料顆粒的大小而非填料的孔徑和化學(xué)性質(zhì)[3８]。填料的作用僅被用來形成填料之間的網(wǎng)狀空隙，當(dāng)DNA分子進(jìn)入色譜柱，它需要不斷繞過填料顆粒的球型障礙，就像障礙滑雪一樣，DNA分子越大或填料顆粒越小，則DNA分子穿出色譜柱也越困難。這樣大的DNA分子在填料顆粒間的移動(dòng)速度小于小的DNA分子，*終在小分子之后被洗脫出來[3９]。Guillaume等[4０]對(duì)SC的機(jī)理進(jìn)行了研究，提出了DNA分子在SC里分離的模型，并對(duì)該模型進(jìn)行的驗(yàn)證[4１]。該模型給出了相對(duì)保留值與流動(dòng)相流速的關(guān)系：τ＝ψ(e－kv kv－１)＋τˇ(２)式中，τ為流速在v時(shí)DNA分子的保留時(shí)間與其完全舒展時(shí)(對(duì)應(yīng)于其*高流速時(shí))的保留時(shí)間的比值，ψ，k為相應(yīng)的常數(shù)，τˇ為*低流速時(shí)的τ值。從式(2)看出，SC模式中溶質(zhì)的保留值是流速的函數(shù)。他們從理論上推導(dǎo)出的與實(shí)驗(yàn)得出的τ進(jìn)行了比較，結(jié)果一致，并給出了τ值與流速v的關(guān)系圖。
　　
　　Hirabayashi等[3９]證明溫度也是影響SC分離的重要因素，原因在于流動(dòng)相的粘度大小與溫度有關(guān)。Peyrin等[4２,4３]根據(jù)溶液粘度與溫度之的關(guān)系給出了在SC中溫度影響DNA保留行為的模型。
　　
　　3.2溶質(zhì)保留與分離對(duì)流速的依賴性
　　
　　SC中兩個(gè)DNA片段的分離可以用式(3)來描述[3９,４4]：
　　
　　RRT=tR/tNR(3)式中，RRT為溶質(zhì)的相對(duì)保留時(shí)間，tR為溶質(zhì)的保留時(shí)間，tNR為死時(shí)間或不保留組分的保留時(shí)間。
　　
　　由于流速對(duì)DNA分子伸展性的影響[４4]，流動(dòng)相對(duì)填料顆粒間的流體動(dòng)力學(xué)力(hydrodynamicforce)對(duì)DNA分子的保留起著重要的作用，隨著流速逐漸增大，相對(duì)保留時(shí)間(ＲＲＴ)增長；流速增大到一定程度后ＲＲＴ趨于穩(wěn)定值。Hirabayashi[３８，３９]和Boyes[３７]等進(jìn)行了驗(yàn)證。Peyrin進(jìn)行了理論推導(dǎo)[４4]，并指出流動(dòng)相流速的增加提高了分離的效率，減小了分離時(shí)間，這也是其相對(duì)于平衡色譜的重要優(yōu)點(diǎn)。
　　
　　3.3SC理論的發(fā)展和應(yīng)用
　　
　　自1988年SC提出以來，雖然發(fā)展很快，但其應(yīng)用范圍較窄，且多集中在SC理論研究和DNA分子片段的分離方面。SC為處理和分析大的DNA分子提供了一個(gè)新的技術(shù)平臺(tái)[４５]，這種方法*大的特點(diǎn)就是溶質(zhì)的分離是依靠于流體力學(xué)現(xiàn)象而非熱力學(xué)中的溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的化學(xué)平衡[３５,3９]。在這種模式里，流動(dòng)相相對(duì)較高的流速會(huì)在柱子內(nèi)填料之間的空隙間形成流速梯度，大的DNA分子由于隨流動(dòng)相移動(dòng)得速度小，比小的更難通過填料顆粒，這樣小分子先于大分子被洗脫出來，其洗脫順序恰恰與排阻色譜模式相反[４６]，顯著影響溶質(zhì)保留值的是各種流體力學(xué)因素有固定相顆粒的大小、流動(dòng)相的流速和溫度，而化學(xué)因素有固定相顆粒的化學(xué)性質(zhì)，孔徑和溶劑的疏水性并不是影響分離的關(guān)鍵因素[４７]。Hirabayashi等[４７]使用兩種CapcellPak反相填料和5種Hypersil3反相填料驗(yàn)證了SC機(jī)理在使用反相色譜柱條件下的可行性，發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相的鹽濃度增加時(shí)，DNA分子的保留值增大，其分離度也增大，他們認(rèn)為這是一種SC和HIC同時(shí)存在的混合分離模式。然而Rittich等[４８]在使用HEMABIO1000填料研究流動(dòng)相鹽濃度對(duì)分離的影響時(shí)，認(rèn)為鹽濃度對(duì)分離幾乎沒有影響。SC*主要的優(yōu)點(diǎn)在于快速和相對(duì)簡單的操作，如在使用凝膠色譜柱時(shí)，用SC能在2min內(nèi)完成分子量分別為4、9和23kb的DNA碎片的分離[45]，增加流速可以進(jìn)一步縮短分離時(shí)間。然而SC的分辨率卻低于SEC。為了提高其分辨率，Peyrin等[４4]提出了描述SC分離DNA分子的模型，得出流動(dòng)相的粘度是影響DNA在SC分離中的重要因素。
　　
　　Hirabayashi等[４９]進(jìn)一步系統(tǒng)地研究了SC中DNA分子的構(gòu)型、溫度及溶劑的粘度對(duì)DNA分子保留的影響。結(jié)果表明，溶劑的粘度決定了DNA分子的保留程度，DNA分子構(gòu)型影響其在SC中保留的是其分子長度，而非分子量，同時(shí)溶劑的粘度也和流速一樣是影響DNA分子保留的主要因素。
　　
　　4HDC與SC的異同點(diǎn)及聯(lián)系
　　
　　HDC主要利用在填料顆粒之間的空隙中產(chǎn)生的平流層來進(jìn)行分離。無規(guī)則盤狀聚合物大分子的分離依賴于其有效半徑reff與填料空隙的有效管徑的比值。當(dāng)流速增加時(shí)，溶質(zhì)分子會(huì)拉伸并變形從而導(dǎo)致該比值的減小[2３]，而這種變形會(huì)隨著流動(dòng)相流速、粘度和溶質(zhì)分子體積增大而增加，當(dāng)該比值大于一定程度時(shí)(＞0.35)，無法完成溶質(zhì)的分離[１９]。而SC的分離強(qiáng)烈依賴于流動(dòng)相產(chǎn)生的水動(dòng)力效應(yīng)，DNA分子在通過顆粒間的時(shí)候會(huì)發(fā)生形變和舒展，這樣在SC中，DNA分子的RRT才會(huì)與DNA分子的大小有一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系,且為顆粒直徑的函數(shù)[4４]，故HDC與SC可相互轉(zhuǎn)換[３２]，即當(dāng)溶質(zhì)分子為盤狀結(jié)構(gòu)且流速較低時(shí)，此時(shí)溶質(zhì)的盤狀形狀未發(fā)生變化，分離按照HDC進(jìn)行；隨著流動(dòng)相流速、溶質(zhì)分子的體積增大到一定程度時(shí)，分離模式從HDC機(jī)理轉(zhuǎn)為SC機(jī)理，此結(jié)論在分離DNA片段[5０]和蛋白質(zhì)[5１]中得到了證實(shí)。
　　
　　5展望
　　
　　HDC和SC借助于填料顆粒間的水動(dòng)力效應(yīng)對(duì)溶質(zhì)進(jìn)行分離。由于在分離過程中不需要滿足溶質(zhì)與固定相之間的化學(xué)平衡，這樣消除掉了溶質(zhì)與填料顆粒間的傳質(zhì)過程。因此，提高了分離速度，使用流動(dòng)相和SEC相同，對(duì)環(huán)境污染較小。由于分離只與動(dòng)力學(xué)因素——流動(dòng)相流速、粘度和填料粒徑有關(guān)，分離操作較為簡單。其“溶質(zhì)保留值與流速之間有依賴關(guān)系”的結(jié)論為提高色譜分離度提供了一條新思路。從動(dòng)力學(xué)上研究溶質(zhì)的分離給現(xiàn)代分離科學(xué)開辟了更為廣闊的遐想空間。如：動(dòng)力學(xué)因素改變時(shí)，溶質(zhì)在各種分離模式中的分離情況、峰容量、分離度和洗脫順序會(huì)有何不同？溶質(zhì)的分離度和流動(dòng)相流速之間有何聯(lián)系？本實(shí)驗(yàn)組研究了反相模式下動(dòng)力學(xué)因素，即：流速對(duì)細(xì)胞色素C的肽譜的影響[５２]，發(fā)現(xiàn)在不同流速時(shí)，肽譜的分離情況、峰容量和分離度也各不相同，甚至部分溶質(zhì)的洗脫順序也發(fā)生了變化，還發(fā)現(xiàn)了兩種變化規(guī)律，即溶質(zhì)相對(duì)保留值(RRT)與流動(dòng)相流速之間存在雙對(duì)數(shù)線性關(guān)系：log(RRT)=a blog(v)(4)以及所得該兩個(gè)線性參數(shù)，a與b之間的的線性關(guān)系：a=c db(5)該結(jié)果在液相色譜指紋圖譜研究和蛋白質(zhì)組學(xué)中分離低豐度蛋白時(shí)有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前由于HDC在操作過程中需要控制的流速較低，因此對(duì)儀器的要求較高，并且自SC提出以來，已發(fā)表的論文多集中在理論研究上，實(shí)際應(yīng)用多限于分離一些DNA分子片段，因此二者的用途有待進(jìn)一步發(fā)展和開拓。
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